一、概要
雌二醇（β-Estradiol）是应用广泛的甾类同化激素，被大量用于促进反刍动物的生长。但由于雌二醇存在明显的致癌性，欧美等国家已相继禁止或严格禁止使用。我国农业部第235号文件中规定，动物源性食品中雌二醇的残留限量为不得检出。由于气相色谱（GC）分析法样本前处理及测定操作繁琐且费用高，使推广应用受到限制。
本试剂盒是应用ELISA技术研发的新一代药物残留检测产品，操作时间仅需1.5小时，能最大限度地减少操作误差和工作强度。
二、试验原理
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物雌二醇和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗雌二醇抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物雌二醇的含量成负相关，与标准曲线比较可得出相应雌二醇的残留量。
三、适用范围
可定性、定量检测动物组织（肌肉、肝脏、虾、鱼等)、尿液、饲料等样本中雌二醇的残留量。
四、交叉反应率
雌二醇 ……………………………………………………100%
雌二醇-3甲醚 ………………………………………………30%
炔雌醇 ………………………………………………………7%
雌酚酮 ………………………………………………小于0.1%
苯甲酸雌二醇 ………………………………………小于0.1%
雌三醇 ………………………………………………小于0.1%
五、使用单位需自备的设备和试剂
仪器：
----微孔板酶标仪450nm/630nm
----旋转蒸发仪/氮气吹干装置
----均质器
----振荡器
----离心机
----刻度移液管：10ml
----天平：感量0.01g
----微量移液器：单道 20ml～200ml、100ml～1000ml
多道 250ml
试剂：
----三氯甲烷 （分析纯）
----乙腈（组织专用）（分析纯）
----氢氧化钠（组织专用）（分析纯）
┅┅浓磷酸（含量85%）（饲料专用）（分析纯）
----Glucuronidase/ Arylsulfatase(葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶)
----去离子水
六、提供的材料与试剂
1、 96孔酶标板×1块 （包被有偶联抗原）
2、 标准液×6瓶：（1ml/瓶）
0ppb，0.5ppb，1.5ppb，4.5ppb，13.5ppb，40.5ppb
3、高浓度标准品：（1ml/瓶） 1ppm
4、 酶标二抗 12ml …………………………… 红色帽
5、 抗体工作液 7ml …………………………… 绿色帽
6、 底物液 A液 7ml …………………………… 白色帽
7、 底物液 B液 7ml …………………………… 红色帽
8、 终止液 7ml …………………………… 黄色帽
9、20×浓缩洗涤液 40ml …………………………… 透明帽
10、2×浓缩复溶液 50ml …………………………… 透明帽
七、溶液的配制
配液1: 0.1M 氢氧化钠溶液
称取0.4g氢氧化钠加去离子水溶解定容至100ml
配液2: 1M 氢氧化钠溶液(组织专用)
称取4 g氢氧化钠加去离子水融解定容至100ml
配液3:乙腈-0.1M 氢氧化钠溶液(组织专用)
量取84ml乙腈和20ml 0.1M 氢氧化钠溶液混合均匀
配液4: 6M 磷酸溶液
量取100ml 浓磷酸（含量85%） 加去离子水定容至150ml混合均匀
配液5: 乙腈－三氯甲烷混合液
量取50ml乙腈和100m三氯甲烷混合均匀
配液6: 复溶工作液
用去离子水将2×浓缩复溶液按1：1体积比进行稀释（1份2×浓缩复溶液+1份去离子水）用于提取样本的复溶，复溶工作液在4℃环境可保存一个月。
配液7: 洗涤工作液
用去离子水将20×浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释（或按需量稀释）（1份20×浓缩洗涤液+19份去离子水）用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4℃环境可保存一个月。
八、样本前处理步骤
样本处理前须知
处理任何样本时，都必须注意：
（a） 实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。
（b）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果。
（c）未处理的组织样本冷冻保存。
（d）处理好的样本应立即用于检测，室温保存不得超过4小时。
（一）组织 (鸡肉/肝、猪肉/肝、虾、鱼等) 前处理方法
----用均质器均质组织样本；
----称取2.0±0.05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入10ml乙腈-0.1M 氢氧化钠溶液，用振荡器振荡10min，3000g以上，室温（20-25℃）离心10min；
----取1ml上清液至10ml干净的玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；
----用0.5ml三氯甲烷溶解；
----加入2ml 1M 氢氧化钠溶液进行反萃取，剧烈振荡5min，3000g以上，室温（20-25℃）离心10min，取1ml上清液加入100ml 6M 磷酸溶液混匀；
----加入5ml乙腈－三氯甲烷混合液，用振荡器振荡10min，3000g以上，室温（20-25℃）离心10min，取全部下层有机相至10ml干净的玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；
----用1ml复溶工作液溶解干燥的残留物；
----取50ml水相用于分析。
（二） 尿液前处理方法
----取2ml尿液到离心管中，3000g以上，室温（20-25℃）离心10min，直至清亮；
----移取1ml清亮尿液样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入10ml Glucuronidase/ Arylsulfatase(葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶)，在37℃水解3h；
----加入5ml三氯甲烷用振荡器振荡10min，3000g以上，室温（20-25℃）离心10min；
----取下层有机相1ml至10ml干净的玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；
----用1ml 复溶工作液溶解干燥的残留物；
----取50ml水相用于分析。
（三） 饲料前处理方法
----称取2.0±0.05g饲料样本，加入8ml乙腈，用振荡器振荡10min，3000g以上，15℃离心10min；
----取2ml上清液至10ml干净的玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；
----加入0.5ml氯仿，用涡旋仪涡动20s，加入2ml 1M 氢氧化钠溶液，用涡旋仪涡动30s，3000g以上，15℃离心5min；
----取1ml，加入100ml 6M 磷酸溶液，用涡旋仪涡动10s；
----样本溶液与复溶工作液按1：39的体积比进行稀释（25ml样本提取液+975ml 复溶工作液），用涡旋仪涡动混匀；
----取50ml水相用于分析。
注：如添加的浓度除以稀释倍数得到的值还大于40.5时请扩大稀释倍数（如：将样本稀释到320倍），避免检测的结果超出曲线范围导致结果偏大，使用软件处理数据时一定要使用样本实际稀释倍数。
九、检测步骤
测定前应须知：
1、使用之前将所有试剂和需用板条的温度回升至室温（20-25℃）。
2、使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。
3、在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。
4、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。
操作步骤：
1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3、洗涤工作液在使用前也需回温。
4、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
5、加标准品/样本：加标准品/样本50ml 到对应的微孔中，然后加抗体工作液50ml/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min。
6、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液（见配液6）250ml/孔，充分洗涤4－5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。
7、加酶标二抗：加入酶标二抗100ml/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min。，取出重复洗板步骤6。
8、显色：加入底物液A液50ml/孔，再加底物液B液50ml/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境反应15min（见注意事项8）。
9、测定：加入终止液50ml/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，请在5min内读完数据），测定每孔OD值。(若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定)。
十、结果判定
结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，而定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含雌二醇成负相关。
1、用样本的平均吸光值与标准值比较即可得出其浓度范围(ppb)。假设样本1的吸光度值为0.101，样本2的吸光度值为0.532，标准液吸光值分别是：0ppb为1.615；0.5ppb为1.3111；1.5ppb为0.861； 4.5ppb为0.416；13.5ppb为0.144 40.5ppb为0.044。则样本1的浓度范围是13.5ppb-40.5ppb再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中雌二醇残留的浓度范围； 样本2的浓度范围是1.5ppb-4.5ppb，再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中雌二醇残留的浓度范围。
2、定量分析
（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0(ppb)标准溶液的平均吸光度值
（2）标准曲线的绘制与计算
以标准品百分吸光率为纵坐标，以雌二醇标准品浓度（ppb）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中雌二醇实际残留量。
若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）
样本稀释倍数
组织样品(肌肉/肝脏/鱼/虾等)稀释倍数：10
尿样样品稀释倍数：5
饲料样品稀释倍数：160
十一、检测方法灵敏度、准确度、精密度
试剂盒灵敏度：0.5ppb
样本最低检测限：
鸡肉/肝、猪肉/肝、虾、鱼 ………………………………5ppb
饲料 ………………………………………………………80ppb
尿液 ……………………………………………………2.5ppb
准确度：
饲料/组织 ………………………………………… 80±15%
尿 液 …………………………………………… 80±10%
精密度：
试剂盒的变异系数均小于10%
十二、注意事项
1、室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。
2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
3、每加一种试剂前需将其摇匀。
4、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。
5、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
6、储存条件
保存试剂盒于2-8℃，不要冷冻，将不用的酶标板微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
7、试剂变质的迹象
发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5 ）时，表示试剂可能变质。
8、在加入底物液A和底物液B液后，一般显色时间为10-15min即可。若颜色较浅，可延长反应时间到20min（或更长），但不得超过30min。反之，则减短反应时间。
9、该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
十三、贮藏条件及保存期
贮藏条件：保存试剂盒于2~8℃。
保存期：该产品有效期为6个月。
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